在药物研发的广袤领域中，早期筛选出具有潜在生物活性的“苗头化合物”，犹如在浩渺星空中寻觅璀璨星辰，其重要性不言而喻。传统的放射性检测方法，如闪烁亲近检测法（SPA），虽能测试生物功能，但存在诸多局限性，如操作人员面临安全风险、放射性同位素半衰期有限、特殊的废物处理要求等。随着全球对避免放射性废弃物的呼声日益高涨，非放射性替代方法应运而生，其中荧光分析技术凭借其高灵敏度、安全性、操作简便以及适用于高通量筛选等优势，成为现代药物研发平台的核心支撑。
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一、荧光现象的技术本质
荧光现象，从本质上讲，是一种光物理过程。当特定物质（即荧光团或荧光素）受到特定波长的激发光照射时，其分子吸收光能后跃迁到不稳定的激发态。随后，处于激发态的分子会迅速通过释放能量的方式回到稳定的基态，而发射荧光便是其中一种能量释放途径。激发光与发射光之间的能量差，表现为波长差异，这被称为斯托克斯位移（Stokes shift）。这一位移是荧光检测的关键所在，它使得仪器能够借助光学滤光片，将高能量的激发光与低能量的发射光精准分离，从而实现对荧光信号的精确测量。值得注意的是，荧光的产生具有瞬时性，在辐射停止后，该物质的荧光发射几乎即刻停止，通常在纳秒量级。通过检测器对荧光强度随时间的变化进行测量，便可对与荧光信号相关的生物过程进行实时、动态的监测与量化。
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在此基础上，荧光强度分析成为一种较为基础的检测系统。它主要通过直接利用荧光信号的强弱变化，来检测生物反应过程以及受试化合物的活性。该检测系统包含两种基本类型，其设计核心在于将酶的活性转化为可测量的荧光变化。
第一类检测系统通过测量荧光水平随时间的增加来检测生物活性。例如，在常见的荧光检测中，体系中的酶（如蛋白酶或激酶）能够将非荧光底物转化为荧光产物。以使用底物AMC（7 - 氨基 - 4 - 甲基香豆素）进行蛋白酶活性筛选为例，AMC与多肽连接时无荧光，但当蛋白酶将其切割并释放出游离的AMC时，在380nm光激发下会产生460nm的蓝色荧光。对该酶具有抑制作用的化合物，会以可量化的方式减缓荧光产物的形成速率，通过绘制剂量 - 反应曲线，能够计算出使酶活性降低50%的化合物浓度，即IC50值，这是评估化合物效力的关键参数。
第二类检测系统中，酶的作用与第一类相反，它可将荧光底物转化为非荧光产物。例如，某些酯酶能够水解具有荧光的酯类底物，生成无荧光的酸。在这种情况下，酶抑制剂会减缓荧光底物被“淬灭”的速度，因此化合物生物活性的测试将通过检测荧光信号下降的迟缓程度来进行。
然而，不论哪一类荧光强度分析系统，荧光强度的读数都可能受到多种因素的干扰，这被称为检测干扰（assay interference）。例如，化合物本身若具有颜色，会吸收激发光或发射光（称为内滤效应）；或者化合物自身就是荧光物质，会产生背景信号；再或者化合物是荧光淬灭剂，会非特异性地熄灭荧光信号。这些问题可能导致荧光强度分析中出现假阳性（本来无活性，但因干扰显示有活性）或假阴性（本来有活性，但因干扰显示无活性）结果，所以在分析数据时必须通过专门的对照实验予以充分考虑和排除。
二、荧光分析技术的行业应用
（一）荧光偏振（FP）技术
基于光的波动性（偏振特性），荧光偏振（FP）技术应运而生，它是一种更为先进的荧光分析技术。FP技术的独特之处在于，它并非直接测量荧光强度的绝对值，而是通过检测荧光分子在受到偏振光激发后，所发射光子的偏振方向是否发生改变，来间接获取分子在溶液中的旋转速度信息，而分子的旋转速度与分子大小直接相关。
偏振光这一物理概念最早由法国物理学家艾特恩·露易丝·马卢斯（Eitenne - Louise Malus）于1808年发现，远早于现代药物研发系统的出现。100多年后，佩兰（Perrin）和魏格特（Weigert）分别从理论和实验上报道了分子大小、光的偏振和荧光之间的关系，为FP技术奠定了坚实的理论基础。此后，韦伯（Weber）和丹得利克（Dandliker）分别开发出相关仪器和均相（无需分离步骤）分析方法，为FP技术应用于现代药物高通量筛选开辟了道路。
FP的原理可以这样理解：当用偏振光激发溶液中的荧光分子时，只有那些吸收偶极方向与偏振光方向平行的分子才会被激发。若被激发的荧光分子在激发态期间（通常为纳秒级）保持静止不动，那么它发射出的荧光也将保持在同一偏振平面上。然而，若荧光分子处于溶液环境中，在激发态寿命期内会发生随机旋转（布朗运动）。如果分子很小，旋转速度快，在发射光子时其方向已经发生随机改变，导致发射光去偏振化；反之，如果荧光分子与一个巨大的生物大分子（如蛋白质）结合，其整体旋转速度将显著减慢，在发射光子时其方向基本保持不变，从而发射出高度偏振的荧光。因此，偏振值（mP）的高低直接反映了荧光标记分子的大小状态，可用于实时、无创地监测分子间的结合与解离。
在实际应用中，荧光偏振分析技术已广泛应用于生物分子相互作用的检测。例如，在蛋白酶抑制剂的筛选中，没有蛋白酶时，带有荧光基团标记的大分子蛋白底物在溶液中运动缓慢，发射光保持高偏振值。当加入蛋白酶后，大分子底物被切割成小肽片段，这些片段运动速度加快，导致偏振值显著降低。若存在蛋白酶抑制剂，它会减缓底物的切割，从而抑制偏振值的下降。通过监测偏振值变化的速率，能够精确量化抑制剂的活性。此外，FP技术与抗体技术的组合还衍生出了检测蛋白激酶活性的强大方法。在激酶反应中，当偏振光源照射到被荧光团标记的小分子底物多肽时，该小分子底物会产生去偏振的荧光信号。激酶催化底物磷酸化后，在能与磷酸化产物特异性结合的抗体存在下，二者形成巨大的抗原 - 抗体复合物，分子结构的急剧变大导致荧光偏振值显著增加。而在激酶抑制剂存在的情况下，磷酸化产物生成量减少，复合物形成受阻，所测得的荧光偏振值相应减小。这种方法已被广泛应用于癌症药物研发中激酶抑制剂的高通量筛选。同时，利用荧光偏振分析方法还可检测蛋白 - 蛋白相互作用和DNA - 蛋白相互作用的变化。例如，在研究转录因子与DNA结合的实验中，用荧光素标记一段DNA探针。当转录因子与DNA结合形成大复合物时，偏振值升高；若有小分子化合物能竞争性抑制其结合，则会阻止偏振值的增加。这种方法能够高效地测定化合物的结合常数（Kd），为干扰关键生命过程的药物开发提供重要依据。
（二）荧光共振能量转移（FRET）技术
根据德国科学家西奥多·福斯特（Theodor Förster）于1948年发现的荧光共振能量转移（FRET）原理，众多极为灵敏的生物分析方法得以开发。FRET的本质是一种非辐射性能量转移，当两个荧光分子（供体和受体）的距离足够近（通常为1 - 10nm），且供体的发射光谱与受体的吸收光谱有足够重叠时，激发态供体可以将能量直接转移到受体，导致受体发射荧光，而供体自身荧光淬灭。与荧光偏振不同，FRET不依赖于分子整体的旋转运动，而是对分子间距离的变化极度敏感，因此被誉为“分子尺”，非常适合研究生物分子的相互作用、构象变化和切割过程。
FRET技术在药物研发领域有着广泛的应用。例如，早期对HIV蛋白酶抑制剂的发现就是一个里程碑式的案例。当肽链完整时，两者距离很近，供体EDANS被激发后能量高效地转移给DABCYL，导致EDANS荧光淬灭。当HIV蛋白酶存在并切割肽链后，供体与受体分离，能量转移中断，EDANS在490nm处的荧光得以恢复。因此，蛋白酶的活性与荧光强度成正比，HIV蛋白酶抑制剂会抑制切割，从而阻止荧光恢复。基于此原理的检测方法极大地加速了如沙奎那韦等第一批HIV蛋白酶抑制剂的研发进程。此外，FRET技术还可用于研究膜电位和离子通道。在这种设计中，一个FRET供体被标记在细胞膜蛋白上，另一个带电荷的脂溶性FRET受体在细胞膜双层中移动。当细胞膜外正内负时，带负电的受体被吸引至膜外侧，与供体靠近发生FRET。当离子通道开放引起膜电位变化（如去极化）时，受体被驱向膜内侧，与供体距离拉远，FRET信号减弱。这种FRET膜电位探针为光学测量电生理活动提供了一种方法，适用于高通量筛选调节离子通道功能的药物。同时，FRET技术与从维多利亚水母中分离的绿色荧光蛋白（GFP）及其衍生物（如CFP、YFP）的结合，为细胞生物学研究带来了革命性的变化。这些荧光蛋白可以通过基因工程与目标蛋白融合，实现活细胞内生物过程的实时监测。例如，在研究G蛋白偶联受体（GPCR）活性时，可以用CFP和YFP分别标记G蛋白的α和γ亚基。在静息状态下，两个亚基结合，CFP和YFP距离很近，激发CFP可通过FRET产生YFP荧光。当GPCR被激动剂激活后，Gα与Gβγ解离，CFP与YFP距离拉大，FRET信号减弱。通过监测CFP/YFP的荧光比率变化，即可在活细胞水平筛选GPCR的激动剂和拮抗剂。
然而，尽管FRET技术功能强大，但其数据分析存在一定挑战。受试化合物自身的荧光、颜色或淬灭特性会产生严重干扰，此外，细胞自身荧光、培养基和塑料板带来的背景噪声也会降低信噪比和检测灵敏度。
（三）时间分辨荧光共振能量转移（TRFRET）技术
为了解决传统FRET技术中短寿命背景荧光的干扰问题，时间分辨荧光共振能量转移（TRFRET）技术应运而生。TRFRET技术的巧妙之处在于引入了具有长荧光寿命的镧系元素（如铕Eu³⁺、铽Tb³⁺）作为供体。
背景荧光（来自化合物、板、培养基）的寿命极短，通常在纳秒到微秒级内衰减。而镧系元素螯合物在受到脉冲光激发后，其荧光寿命可长达数百微秒甚至毫秒。TRFRET利用这一时间差，在激发脉冲之后，等待短寿命的背景荧光完全衰减殆尽，再打开检测窗口测量信号。此时，只有长寿命的镧系元素供体及其通过FRET激活的受体信号能被检测到，从而几乎完全消除了背景荧光的干扰，获得了极高的信噪比。
TRFRET的应用模式与FRET类似。在激酶活性检测中，生物素化的底物被磷酸化后，可被镧系元素（如铕）标记的磷酸化特异性抗体识别。同时，加入链霉亲和素标记的受体（如异藻蓝蛋白APC）。链霉亲和素与生物素的高亲和力结合将供体（铕）和受体（APC）拉近，产生TRFRET信号。激酶抑制剂会减少磷酸化底物，从而破坏这一“桥梁”，降低TRFRET信号。此外，TRFRET同样可用于检测复杂的细胞内信号通路。例如，为了研究某个GPCR的下游信号，可以构建一个稳定表达GFP标记的激酶底物（如转录因子）的细胞系。GPCR激活会导致该底物磷酸化，细胞裂解后，加入镧系元素标记的、能识别磷酸化底物的抗体。抗体与磷酸化的GFP - 底物结合，使镧系元素供体与GFP受体靠近，产生TRFRET信号。激动剂会增强此信号，而拮抗剂则会抑制由内源性配体引发的信号增强，这种方法实现了在更接近生理环境的背景下进行药物筛选。
（四）放大发光邻近均相检测（Alpha）技术
为了彻底摆脱光物理背景荧光的困扰，研究人员开发了基于化学发光的均相检测技术——放大发光邻近均相检测（Alpha）技术，其核心技术为发光氧通道检测（LOCI），由乌尔曼（Ullman）于1994年首次提出
Alpha技术的核心是两种特殊的微珠：供体珠和受体珠。供体珠含有光敏剂，在680nm光照下，可将环境中的氧气转化为高能量、短寿命的单线态氧；受体珠则含有化学发光剂。关键在于，单线态氧在水溶液中的扩散距离极短（约200nm）。如果两种珠粒是分离的，单线态氧在到达受体珠前就已淬灭。然而，如果待测的生物相互作用（如抗原 - 抗体、生物素 -链霉亲和素）将供体珠和受体珠“拉”到一起，供体珠产生的单线态氧就能直接扩散到邻近的受体珠内，触发化学发光反应，在520 - 620nm波长处产生强荧光信号。
在激酶筛选中的应用示例中，生物素化底物通过链霉亲和素包被的供体珠捕获。磷酸化事件则通过另一株磷酸化特异性抗体捕获，该抗体与受体珠相连。激酶反应成功，则形成“供体珠 - 生物素 - 底物 - 磷酸化 - 抗体 - 受体珠”的免疫复合物，产生信号。抑制剂阻止磷酸化，复合物无法形成，信号消失。该方法灵敏度极高，动态范围宽，非常适合复杂样本（如细胞裂解液）中的检测。Alpha技术已广泛应用于研究蛋白 - 蛋白相互作用、GPCR信号、激酶/磷酸酶活性等，只要生物过程能控制两种珠子的邻近性（proximity），就可设计出相应的Alpha检测方法。
（五）钙通道的荧光检测技术
细胞内钙离子（Ca²⁺）作为重要的第二信使，在GPCR激活、肌肉收缩、神经递质释放等众多生命过程中起着核心作用。因此，监测细胞内Ca²⁺浓度的变化成为药物筛选，尤其是GPCR药物筛选的重要途径。
目前，主要有两类钙通道的荧光检测方法。第一类方法是使用钙敏感性荧光染料，如Fluo - 3、Fluo - 4。这些染料本身荧光很弱，但与Ca²⁺结合后，荧光强度可增强数十至上百倍。在GPCR研究中，许多受体通过Gq蛋白激活磷脂酶C，产生IP3，进而促使内质网中的Ca²⁺释放到胞浆。将细胞预先加载Fluo - 4/AM（AM酯为细胞穿透性形式，入胞后被酯酶水解为活性形式），当加入GPCR激动剂后，胞内Ca²⁺浓度瞬间升高，与Fluo - 4结合，导致荧光信号急剧增强，可通过荧光成像或读板机实时捕获。拮抗剂则会抑制由内源性配体引起的钙流信号。此类方法操作相对简单，信号幅度大，是GPCR高通量筛选的常用手段。但它也存在一些缺点，如染料可能对细胞有毒性，且易受化合物干扰和光漂白影响。
第二类方法是基于水母发光蛋白（aequorin）的生物发光检测。水母发光蛋白是一个由脱辅基蛋白、辅因子腔肠素（coelenterazine）和氧分子组成的复合物，当Ca²⁺与脱辅基蛋白结合，会立即催化腔肠素氧化，产生二氧化碳和蓝光（~469nm）。通过基因工程让细胞稳定表达水母发光蛋白，并在检测前用腔肠素孵育。当GPCR被激活引起钙流时，即可触发生物发光。此方法的巨大优势在于无需激发光，完全避免了光背景和染料的干扰，灵敏度极高，信噪比非常好。它已成为研究许多难治型GPCR（尤其是内源性表达水平低的受体）的重要工具，但其局限性在于需要基因操作，且能淬灭腔肠素化学发光反应的化合物会产生假阴性。
三、荧光分析系统的技术优势与行业影响
随着荧光分析技术的不断发展，其在药物研发领域的应用日益广泛，为药物发现提供了丰富而强大的工具箱。从简单的荧光强度检测，到精巧的FP、FRET、TRFRET，再到独特的Alpha和钙检测技术，每种技术都有其独特的优势和适用场景。研究人员可根据靶点类型、检测通量、信号背景比和成本等因素，选择最合适的策略，从而在浩瀚的化合物库中精准地寻找未来的药物分子。
在这一过程中，检测设备的发展也至关重要。例如，景颐光电自主研发的荧光发光效率检测仪，为荧光分析技术提供了有力的支持。该系统主要用于材料（溶液、粉末、薄膜）荧光量子效率的测量，测试系统经过可溯源的光源进行定标，能够进行准确的绝对量子产率、色度测量，同时可以实现光致发光谱的测量和记录。除更换光源、取放样品等操作外，其他测量所需操作均可在软件界面上完成，实现自动化测量。与传统荧光光谱仪相比，荧光发光效率检测仪具有测量稳定、快速、可靠，体积小，使用方便等优点，为荧光探测和量子效率测量提供了一种低成本的解决方案，适合相关高校和科研单位选购。
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景颐光电在荧光检测设备领域的不断创新，推动了荧光分析技术在药物研发等领域的进一步应用和发展，为行业的进步做出了重要贡献。
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