荧光寿命：分子激发态的时间标尺

荧光寿命，也就是分子从激发态返回基态前所经历时间的平均值，它是荧光物质的一项重要参数。从微观层面来讲，分子吸收光子之后，会从基态电子能级（S₀）跃迁至第一激发态（S₁）的高振动能级，之后通过振动弛豫抵达S₁的振动基态，接着或许会通过辐射跃迁发射光子返回S₀，也可能通过非辐射跃迁耗散能量。辐射跃迁速率常数kᵣ与各种非辐射跃迁速率常数之和∑kₙᵣ一同描述了分子从激发态布居到跃迁衰减回基态的过程。

在实验测定时，通常采用短脉冲光源（像激光、LED或者闪光灯）激发分子群体，然后记录荧光强度随时间衰减的曲线。对于单荧光寿命体系的分子群，其强度衰减遵循指数衰减模型，这里的t表示激发后的时间，I₀为初始荧光强度。当荧光强度衰减至其初始值的1/e（大约0.368）时所对应的时间就是荧光寿命τ。在实际分析过程中，为了更直观地观察和分析数据，也能够用对数坐标绘制荧光衰减曲线，也就是以log(I(t))为纵轴、时间t为横轴进行作图，对于单寿命衰减体系，这种关系呈现为一条直线。

 

量子产率：光致发光效率的关键指标

量子产率（Φ）是衡量光致发光过程中能量转换效率的重要参数，狭义上它被定义为发射光子数与吸收光子数之比，可以用0~1之间的小数来表示，也能换算成百分比。例如，要是某体系吸收100个光子后发射30个光子，那么其量子产率就是0.3（或者30%）。荧光过程中发射光子的数量实际上是由kr和knr决定的，所以量子产率还能够由下式表示。

量子产率的测定方法主要有绝对量子产率测定方法和相对量子产率测定方法。

绝对量子产率测定方法

原理：把样品放置在荧光量子效率测定仪中，荧光量子效率测定仪是一个内壁涂有高反射性材料的空心球体，其功能是收集和均化光信号。用激发光照射样品之后，荧光量子效率测定仪内壁会将所有光（包含透射的激发光、样品发射的荧光、散射光）多次反射并均化。球壁上的探测器能够捕捉到所有的光信号，再经过少数几次的测量，排除干涉光的影响，最后通过数据处理得到表征结果。

优点：直接测量，无需参照样；能准确测量散射样品（粉末，悬浮液）；能有效矫正自吸收和内滤效应；结果十分可靠。

缺点：设备昂贵。

 

相对量子产率测定方法

原理：通过将待测样品的荧光强度与已知量子产率标准样品的荧光强度作比较，计算得到相应的量子产率。фs可由下式计算，下标S表示待测样品，R表示参考样品。ф为量子产率，I是积分荧光强度（整个光谱面积），A是溶液在激发波长 (λex)下的吸光度，n为溶液折射率。

要点：荧光项(Iₛ / Iᵣ)：在荧光光谱仪上测量样品和参照物的荧光发射光谱，并对整个光谱进行积分，而且测试环境要使用完全相同的仪器参数（激发波长、狭缝宽度、积分时间等）。吸光度 [(1 - 10⁻ᴬʳ) / (1 - 10⁻ᴬˢ)]：使用紫外可见分光光度计测量样品和参照物在激发波长λex处的吸光度，为了最小化内滤效应，溶液在激发波长处的吸光度建议低于0.1，并且要使用完整的吸光度项进行计算，以获取更准确的结果。折射率项 (nₛ² / nᵣ²)：尽可能使用相同的溶剂，这样该项等于1，可以简化计算并避免潜在误差。

优化：为了提高实验的精度与可靠性，还可以进一步做多点测量与线性拟合。在进行多点测量时，对上式的荧光项和吸光度进行移项得到新的式子。具体操作是对不同浓度的每一溶液测量得到IS、IR、AS、AR ，然后绘制Iₛ——1 - 10⁻ᴬˢ图与Iᵣ——1 - 10⁻ᴬʳ图，并计算斜率Gradₛ和Gradᵣ ，最后将所有参数带入多点测量公式得到样品的相对量子产率。

在这方面，景颐光电自主研发的JY - QEY6500 - PLS型荧光量子效率测试仪具有显著优势。该系统主要用于材料（溶液、粉末、薄膜）荧光量子效率的测量，测试系统经过可溯源的光源进行定标，能够进行准确的绝对量子产率、色度测量，同时可以实现光致发光谱的测量和记录。除更换光源、取放样品等操作外，其他测量所需操作只要在软件界面上就可完成，实现自动化测量。与传统荧光光谱仪相比，整个系统具有体积小、使用方便等优点，为科研工作者提供了一种低成本、高效的荧光探测和量子效率测量的解决方案，尤其适合相关高校和科研单位选购。

 

荧光各向异性：揭示分子运动与取向的奥秘

当样品受到偏振光激发时，荧光基团会在吸收和发射光子过程之间旋转，这种旋转会致使发射的光向各个方向振动，相对于激发的偏振光，这种发射光是去偏振的，去偏振程度就是各向异性。通过分析分子吸收和发射之间的旋转动力学，能够获取分子运动与取向的关键信息，在生物化学与生物物理学领域有着重要应用，例如可用于研究电子结构、溶剂化效应、大分子构象、结合动力学及蛋白质相互作用等。

技术原理

各向异性与分子的旋转运动呈正相关。较大的分子或者在粘性溶液中的荧光团，由于转动受限，会显示出更高的各向异性；而自由旋转的分子（如小分子或处于低粘度溶液中的分子）则显示较低各向异性值。旋转弛豫时间可作为分子尺寸、溶剂化效应、聚集状态及结合特性等参数的重要表征指标。

值得注意的是，荧光分子对光子的吸收具有选择性，荧光分子最容易吸收与其跃迁偶极矩方向一致的偏振光，即吸收跃迁偶极矩方向与入射光电场矢量方向平行的分子将获得优先激发，而与之垂直的分子则保持在基态。由于溶液中分子的随机取向，使得样品中分子荧光发射强度不同。

 

测定荧光各向异性

偏振激发：首先用垂直偏振光激发样品。分子旋转：激发的分子由于布朗运动而旋转。偏振发射：分子发光，但与激发光相比，发射光的偏振受分子旋转的影响。测量偏振：在发射侧加入偏振滤光片，分别测定与激发光偏振方向平行及垂直的发射光强度。计算各向异性：用平行和垂直光强的差值来计算各向异性值。

准确理解和掌握荧光寿命、量子产率以及荧光各向异性等荧光基础特性，对于推动荧光检测技术在众多领域的应用和发展具有重要意义。景颐光电的相关产品也为科研和应用提供了有力的支持。

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